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人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)使用說明書
BS-9809人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)ELISA試劑盒
一、產(chǎn)品概述
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，專用于檢測(cè)人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清等樣本中的VEGF-A濃度。僅供科研使用。
二、試劑盒組成
預(yù)包被微孔板?：12孔×8條(96孔規(guī)格)或12孔×4條(48孔規(guī)格)，預(yù)包被抗VEGF-A捕獲抗體。
標(biāo)準(zhǔn)品?：凍干粉，需用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶后倍比稀釋(建議濃度梯度：10、3.33、1.11、0.37、0.12、0.04、0 ng/mL)。
檢測(cè)抗體-HRP?：辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗VEGF-A抗體。
洗滌緩沖液?：20×濃縮液，需用蒸餾水按1:20稀釋。
底物溶液?：TMB顯色液A/B，使用前1:1混合，15分鐘內(nèi)用完。
終止液?：2M溶液。
樣本稀釋液?：用于稀釋高濃度樣本。
封板膜?：2張，用于溫育時(shí)密封微孔板。
三、實(shí)驗(yàn)原理
VEGF-A與預(yù)包被捕獲抗體結(jié)合，形成“抗體-抗原"復(fù)合物;加入HRP標(biāo)記檢測(cè)抗體后，形成“夾心結(jié)構(gòu)"。經(jīng)洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)，加入TMB底物顯色(藍(lán)色)，終止液終止反應(yīng)后變黃色。450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(OD值)，濃度與OD值呈正比。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
樣本準(zhǔn)備?
血清/血漿：離心去除顆粒物，避免溶血;2-8℃保存≤48小時(shí)，長(zhǎng)期保存需-20℃/-80℃(避免反復(fù)凍融)。
細(xì)胞上清：離心取上清，避免含高濃度蛋白酶劑。
試劑準(zhǔn)備?
洗滌液：濃縮洗滌液室溫結(jié)晶時(shí)，40℃水浴溶解后按1:20稀釋。
標(biāo)準(zhǔn)品：復(fù)溶后倍比稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。
底物：TMB A/B液1:1混合，避光保存。
操作流程?
加樣?：每孔加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，37℃孵育90分鐘。
洗滌?：甩干孔內(nèi)液體，用洗滌液浸泡1分鐘/次，重復(fù)3次。
加檢測(cè)抗體?：每孔加入100μL HRP標(biāo)記抗體，37℃孵育60分鐘。
洗滌?：同步驟2。
顯色?：每孔加入90μL TMB底物，37℃避光孵育15-20分鐘。
終止?：每孔加入100μL終止液，混勻后30分鐘內(nèi)測(cè)定OD值。
結(jié)果計(jì)算?
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
根據(jù)樣本OD值代入曲線計(jì)算濃度，乘以稀釋倍數(shù)得結(jié)果。
五、注意事項(xiàng)
試劑保存?：未使用試劑盒需2-8℃避光保存，有效期6個(gè)月;復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品可分裝凍存，避免反復(fù)凍融。
樣本處理?：避免使用含的樣本，防止HRP活性。
操作規(guī)范?：移液需，避免氣泡;洗滌需，防止交叉污染。
安全防護(hù)?：終止液含強(qiáng)酸，需戴手套操作。
六、預(yù)期結(jié)果
靈敏度?：≤1.54 pg/mL(實(shí)際以說明書為準(zhǔn))。
檢測(cè)范圍?：典型范圍為3.12-200 pg/mL，部分試劑盒擴(kuò)展至62.5-2000 pg/mL。
重復(fù)性?：板內(nèi)/板間變異系數(shù)分別<10%和<15%。
七、常見問題解答
Q?：顯色過淺或過深?
A?：調(diào)整樣本稀釋倍數(shù)或孵育時(shí)間;確保底物新鮮配制。
Q?：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差?
A?：檢查復(fù)溶操作，避免氣泡;更換移液器吸頭。
注：以上僅供參考，本產(chǎn)品僅供科研使用，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。
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